İnsanoğlunun yüzyıllardır cevap aradığı "Yaşam nedir?" sorusu bir sü­re daha kafamızı meşgul edecek gibi görünüyor. Ancak cevaba hiç bu ka­dar yakın olmamıştık. Bilim adamları artık bu soruya doğrudan bir yanıt bulmaya çalışıyor. Nasıl mı? Bir tane daha yaparak!
Ünlü bilim adamı Craig Venter, 2003 yılı Kasım ayında yaklaşık beş bin baz uzunluğunda bir virüs geno­munu yapı taşlarından iki hafta gibi rekor bir sürede sentezlemeyi başardı. Bakteri hücrelerine aşılanan virüs DNA'sının tamamen işlevsel olduğu, tıpkı doğalı gibi virüs proteinleriyle kaplı yeni genomların başka virüsler içine girerek kendilerini kopyalayabil­diği gözlendi. Projeyi destekleyen ABD Enerji Bakanlığı yetkilisiyle bir­likte başarısını ilan eden Venter yeni hedefinin yaklaşık üç yüz bin baz uzunluğunda bir bakteri genomu sen-tezlemek olduğunu açıkladı. Yaşam için gerekli asgari genetik bilgiyi taşı­yacak olan bu kromozomun, DNA'sı çıkarılmış bir bakteriye nakliyle, ilk yapay yaşam yaratılmış olacak. Hem Venter hem de ABD Enerji Bakanlığı, henüz doğmamış bu yapay bakteriyle ilgili büyük umutlar taşıyorlar.
Venter'in geliştirdiği yeni yöntem, 5-6 bin baz uzunluğundaki DNA par­çalarının, sentetik oligonükleotitler-den kalıp kullanılmadan sentezlenme­si için gerekli zamanı önemli ölçüde kısaltıyor. Bakteri virüsü 0X174'ün 5386 baz uzunluğundaki genomunun kimyasal olarak sentezlenmesi yalnız­ca 14 gün sürdü. Bir önceki yıl yapı
BİLİM ve TEKNİK 38 Nisan 2004
taşlarından sentezlenen ilk virüs olan çocuk felci virüsünün 7440 baz uzun­luğundaki genomunun tamamlanma­sının üç yıl sürdüğü düşünüldüğünde, Venter'in başarısının büyüklüğü ko­layca anlaşılıyor. Yeni virüs parçacık­ları oluşturma yeteneğine sahip ge­nom, doğal virüsler kadar olmasa da işlevsel. 0X174'ün genomu oldukça sıkı bir genetik örgütlenme gösteri­yor: İki farklı okuma çerçevesi üzerin-
den okunan genler bazı bölgelerde üst üste çakışıyor. Bu durum işlevsel bir genom elde etmek için oldukça ha­tasız bir baz diziliminin sağlanmasını zorunlu kılıyor. Venter'in tekniğinde, ortalama her beş yüz bazda bir baz yanlış yerleşiyor. Bu hata oranına rağ­men sentezlenen DNA zincirlerinden tamamen hatasız olanlar da belirlen­miş. Daha kusursuz DNA zincirleri el­de etmek için yanlış yerleşmeleri dü-
zeltmek günümüz teknikleri içinde olanaklı.
Venter'in DNA sentezi için geliştir­diği yeni yöntem son otuz yılda hızla gelişen DNA dizi analizi tekniklerinin çok gerisinde kalan DNA sentez tek­niğinin aradaki açığı kapatmasını sağ­layabilir. Eğer DNA sentez ve dizi analizi tekniklerini aynı verimlilikte kullanılabilirsek genomik çalışmala­rında ve pratik uygulamalarında sınır­sız olasılıklar doğacak. DNA'nın do­ğal kaynaklardan klonlanmasındansa kimyasal yollarla sentezlenmesi için pek çok neden var. Baz dizilimi belir­lenmiş DNA'larda analizin doğruluğu­nun kontrol edilmesi bunların başın­da geliyor. Ancak araştırmada kullanı­lacak doğal DNA'nın elde olmadığı durumlarda araştırmacıların dizisini bildikleri bir DNA molekülünü sen-tezleyebilmeleri bilim adamlarına pek çok yeni olanak sunacak. Doğada var olmayan, tasarlanmış, yapay bir prote­ine ait DNA zincirini sentezlemek, va­rolan bir gen bölgesi yeniden tasar­lanmak ya da bir fosil örneğine ait parçalanmış bir DNA'nın yeniden bir­leştirilmesi yeni teknikle mümkün olacak. Bilim adamları başka bir ko­nağın kullanımına sunmak üzere DNA kodunda küçük değişiklikler ya­pacak ya da gen bölgesine çok yakın düzenleyici sinyalleri değiştirerek ko­naktaki gen ifadesinin miktarı ve biçi­mi değiştirebilecekler. Dahası teorik olarak belirlenmiş atasal bir DNA zin­cirini üreterek evrimsel geçmişimizi bugüne getirebilecekler. DNA sentezi, her biri biyolojide çığır açabilecek
tüm bu olasılıkları mümkün kılacak. Dizi analiz teknikleri ilk kullanılmaya başlandığında hem pahalı ve hem de çok emek istiyordu. Bu yüzden de kullanımı oldukça sınırlıydı. Teknik ucuzlaşıp, kolaylaştıkça kullanımı yaygınlaştı. DNA sentezini de benzen bir süreç bekliyor. Sentetik genomik yaygınlaştıkça çok çeşitli, karmaşık ve yeni kimyasal süreç tasarlanacak, bu teknikler enerji, eczacılık ve tekstil alanlarında yeni yaklaşımları doğura­cak. Ancak sağladığı bu önemli ilerle­meye rağmen Venter'in destekçileri de, şüpheciler de bu işteki bir sonraki aşama olan asgari genomu taşıyacak olan, en azından 300 bin baz uzunlu­ğundaki genomun sentezlenmesinde tekniğin işe yarayıp yaramayacağın­dan emin değil. Bir virüsten bir mik­rop genomuna atlayabilmek gerçek­ten büyük bir adım olacak.
Genomdan Yaşama
Peki Venter'in yapay kromozomu çalışırsa ve laboratuvar ortamında as­gari genomla yaşayabilen yapay bir ya­şam üretildiğinde ne olacak. Venter'in bu minik organizmayla ilgili büyük planlan var. Eğer ekip işleyen geno­mik bir iskelet inşa etmeyi başarırsa bu iskelet üzerine ekleyecekleri yeni genlerle -belki bin kadar yeni gen- çok farklı biyolojik işlevleri olan mikrosko­bik fabrikalar kurmayı planlıyor. Bu yeni işlevler arasında alternatif biyolo­jik enerji kaynaklan yaratmak, karbon gazı emisyonunu düşürmek, radyoak­tiviteyle kirlenmiş alanları temizlemek
de var. Venter'in çalışmalarını destek­leyen ABD Enerji Bakanlığı, Venter'i genomik araştırmalardan elde edilen teorik bilgilerin pratiğe aktarılması için ayırdığı bütçeden destekliyor. Venter'in bu amaçla kurduğu Alterna­tif Biyolojik Enerji Enstitüsü (IBEA) araştırmacıları, üzerinde çok az çalış­mış yüzlerce deniz bakterisinin geno­munu yararlı genler bulmak umuduy­la araştırıyor.
Yapay yaşam nanoteknoloji araştır­macılarının da ilgisini çekiyor. Har-vard Tıp Okulu'ndan George Church: "Biyolojik sistemler neyi iyi yaparlar?" diye soruyor ve cevabını kendisini ve­riyor. "Bir şeyler inşa etmekte gerçek­tende çok iyiler." Bu onları DNA hafı­za bankaları gibi yaşayan nano-fabri-kalar inşa etmek isteyen nanoteknolo­ji araştırmacıları için çekici kılıyor. An­cak bunu yapabilmek için sistemin davranışlarının biliniyor ve tahmin edilebilir olması gerekiyor. Bunu sağ­lamanın iyi bir yolu da yaşamı yapı taşlarından yeniden yapmak. Church diğer yandan da evrimin repertuarını geliştirmek istiyor. Canlıların protein­leri inşa ederken kullandıkları toplam 20 amino aside ek olarak yapay amino asitleri de içeren proteinler yaparak proteinlerin kimyasal yeteneklerini ge­liştirmek istiyor. Bilim adamları bu ya­pay amino asitlerin biyokimyaya ve tıbba kazandıracağı büyük potansiyel hakkında tahminlerde bulunmaya he­nüz başladılar.
Diğer yandan pek çok insan yapay yaşamın doğuracağı tehlikelerden do­layı endişeli, eğer bu yaratıklar kulla-
Nisan 2004 39 BİLİM ve TEKNİK
Geleceğin Genlerini Taşıyan Mikroorganizmalar
Mikroorganizmalar hemen her ortam koşulunda ya­şayacak ve pek çok kaynaktan enerji üretebilecek bir metabolik çeşitliliğe sahipler. Bu çeşitlilik onla­rın çok çeşitli biyokimyasal yeteneklerinden kaynak­lanıyor. Yapay yaşam ve genomik araştırmalar bize bu engin dünyanın kapılarını açmak üzere...
nıldıkları yerlerden doğal çevreye ka­çarlarsa ya da tekno-teröristler bağı­şıklık sistemimizin baş edemeyeceği öldürücü mikroplar yaratırlarsa ne olacak. Organizmaların asgari genom taşımaları burada kilit nokta çünkü tüm ihtiyaçları yaşama ortamlarına bi­lim adamları tarafından konulan ya­pay bakteriler tıpkı küçük bebekler gi­bi elden beslenecek. Yapay canlılar do­ğal koşullarda yaşama şansları sıfır olacak şekilde tasarlanacaklar.
Craig Venter yapay kromozom ça­lışmalarına başlarken, biyolojik silah tehdidine karşı araştırmalarının tüm ayrıntılarını açıklamayabileceklerini duyurmuştu. Ancak yukarda sayılan nedenlerle yapay yaşamın biyolojik si­lah olarak kullanılması da olası görül­müyor. Biyolojik silah üretimde zaten başarılı ve çevrede yaygın olarak bulu­nan organizmalara, onları ölümcül ya­pacak birkaç gen eklemenin, bütün organizmayı yeni baştan yapmaktan çok daha verimli bir yol olacağı söyle­niyor.
den oluşan menüsünde uranyum ve plütonyum da bulunması araştırmacıların ilgisini çekiyor. Uranyu­mu kullanırken, onu suda çözülebilir biçiminden çö­zünmez biçimine çevirerek çökerten bakteri, uran­yumla kirletilmiş yer altı sularının temizlenmesinde ve toprağa geçen uranyumun sonradan çıkartılma­sında kullanılabilir. ABD Enerji Bakanlığı bakteriyle alan çalışmalarına başlamış. Bu bakterinin yakın akrabası olan G. sulfurredu-cens'le yapılan alan çalışmalarında sudaki uranyumu %90 oranında azaltmayı başarmışlar. Bakterinin uranyumu besin olarak kullanırken kullandığı süreç aynı zamanda bataryalar için alternatif bir enerji kaynağı oluşturuyor. Araştırmacılar Geobacter hüc­relerinden elektrik akımı elde etmeyi başarmış. Ge­obacter gücüyle çalışan bir otomobil belki hiç yapı­lamayabilir. Ancak okyanus tabanında çalışacak bil­gisayarlara güç kaynağı sağlamakta kullanılabilirler.
Methanoccus jannaschii: Önemli bir enerji kaynağı olan metanı üreten bu bakteri, endüstriyel süreçler­de kullanılmasını sağlayacak yüksek sıcaklık ve ba­sınca dayanıklı enzimlere sahip
Yapay
Kromozomlardan Yapay Yaşama
Wöhler'in 1828 yılında üre'nin kimyasal sentezini başarmasından be­ri yaşamın kimyasal olarak sentezlen-mesi, sentetik organik kimyanın önün­de aşılması gereken bir hedef olarak duruyor. DNA'nın genetik rolünün an­laşılmasından bu yana çabaların bü­yük bölümü oligonükleotidlerin (kısa DNA zincirleri) ve genlerin sentezlen-mesi yönünde harcandı. Venter'in giri­şimi bugüne kadar bu amaçla atılmış en büyük adım.
1999 yılında Venter'in ekibi her hücre için bir genin etkinliğini boza­rak yaklaşık 300 genden oluşan asga­ri bir prokaryotik genom tanımladı. Kendini kopyalayabilen hücresel ya­şam için gerekli tüm bilgiyi taşıdığını düşündükleri bu genomum işlerliğini test etmek isteyen ekip asgari genomu taşıyan sentetik bir kromozom hazırla­yarak bakteri hücresinde denemeye karar verir. Venter yapay yaşam yarat­ma isteğini duyurduktan sonra Geno­mik Etiği Grubundan etik onay almak üzere çalışmalarını durdurdu. 2002 yı-
Deinococcus radiodurans: Aşırı derecede yüksek radyoaktiviteye dayanabilen bu bakteri aynı zaman­da radyoaktif atıkların temizlenmesinde kullanılabi­lecek özellikler de taşıyor.
Polaromonas naphthalenivorans: New York yakınla­rındaki bir çöplükte bulunan bu bakteri kömür kat­ranında bulunan naftalini parçalıyor. Naftalinin ken­disi önemli bir kirletici değil ancak kömür katranın­da bulunan pek çok başka kimyasal madde yer altı sularını kirletip önemli çevresel sorunlara yol açma potansiyeli taşıyor. Bakterinin keşfi kimyasal atıkları parçalayan bakterilerin araştırılması ve tanımlanma­sında bilim adamlarına cesaret veriyor. Mikoplazmalar bilinen en küçük serbest yaşayan hücrelerdir, hücre duvarları olmayan, parazit yaşa-
Thalasssiosira pseudonana: Okyanuslarda yaşayan bir diyatom olan bu canlının, atmosferdeki karbo­nun okyanusların tabanına pompalanmasını sağlayan biyolojik süreçlerde önemli bir yeri var. Bu özellikle­rinden küresel ısınmanın durdurulmasında yararlanı­labilir.
Geobacter metallireducens: Yeryüzünün derinliklerin­de güneş ışığından ve oksijenden uzakta yaşayan bakterilerden biri. Demir ve manganez gibi metalleri tüketerek yaşamını sürdürüyor. Bakterinin metaller-
ma uyumlu, alışılmadık derecede küçük bir genoma sahip bu prokaryot grubunun basit yapıları nedeniy­le tüm canlıların ortak atasının en yakın akrabası olabileceği düşünülüyordu. Venter'in genom dizilimi­ni bulmasıyla Mycoplasma genitalium'un aynı za­manda bilinen en az sayıda gene sahip serbest yaşa­yan hücre olduğu da ortaya çıktı.
BİLİM ve TEKNİK 40 Nisan 2004
lında Venter'in TIGR'i tarafından sı­nırsız şekilde desteklenen, etik araştır­macıları ve dini liderlerin katılımıyla düzenlenen bir panelden, insanoğlu­nun faydası İçin gerekli önlemlerin alınması koşuluyla Venter'in araştır­masının etik olduğu görüşü çıktı. Ven­ter izinle birlikte ABD Enerji Bakanlı­ğından da, yaşam için gerekli asgari sayıda geni taşıyan tek hücreli bir or­ganizma yaratmak üzere 3 milyon do­lar destek alır.
Günümüz teknikleriyle temel kim­yasal maddelerden bütünüyle yapay bir bakteri yapmak mümkün görün­müyor. Bunun yerine Venter ve ekibi; basit kimyasal molekülleri sentezleye-rek oluşturacakları tamamen yapay bir kromozomu, DNA'sı çıkarılmış başka bir bakteriye aktarmayı planlı­yor. Nobel ödüllü Hamilton Smith'de Venter'in ekibinde çalışmalara aktif olarak katılıyor. Smith, DNA molekül­lerini kesip yapıştırmakta kullanılan restriksiyon enzimlerinin kaşiflerin­den biri. Yapay bir kromozom sentez-lemek için 500 bin bazdan oluşan DNA zincirleri sentezleyebilmek gere­kiyor. Ancak Venter'in planın duyur­duğu sırada 5 bin bazdan daha uzun DNA zinciri sentezlemek mümkün de-
ğildi. DNA sentezi sırasında birkaç bazın yanlış yer­leşmesi olağan bir durum ancak zinci­rin uzunluğu artıkça yanlış oranı da giderek artıyor ve sonunda istediğiniz diziyle ilgisi olmayan bir zinciriniz oluyor. Çalışan bir kromozom istiyor­sanız hata oranın oldukça düşük ol­ması gerek. Venter üç-dört yıl içinde ilk yapay yaşam örneğini sentezleyebi-leceğini açıkladığında bunu olası gö­renlerin sayısı pek fazla değildi. Yalnız iş yapay kromozomu sentezlemekle bitmiyor, bunu bir hücrenin içine nak­ledince ne olacağını şu anda kimse bil­miyor. Sentezlenmiş genom hücre içinde öylesine işlevsiz bir şekilde de kalabilir. Venter'in bu soruya cevabı bunu bilmenin yalnız bir tek yolu ol­duğu şeklinde; deneyip, görmek. Biyo-kimyacıların küçük gen takımlarını
hücreler içine sürekli soktuklarını ve her seferinde bakterilerin mutlu bir şekilde yeni proteinler üretmeye baş­ladığını söyleyen Venter, aynı şeyin hazırlanan yapay genomla da olması­nın onu hiç şaşırtmayacağını söylüyor. 2002 yılında İlk yapay kromozo­mun sentezlendiği haberi ne var ki bi­limsel kamuoyunda herkesçe sevinçle karşılanmadı. Araştırmacılar çocuk fel­ci virüsünün genomundan oluşan İlk uzun DNA zincirinin kalıp kullanma­dan kimyasal yollarla sentezlemişler-di. New York Eyalet Üniversitesi'nden virolog Wimmer ve ekibi internetten indirdikleri çocuk felci virüsünün DNA diziliminden, kendilerine posta yoluyla ulaşan malzemeyle gerçek virüsler sentezlemeyi başarmıştı. İşin garibi bu ha­berden mutlu olmayanların en başında Venter geliyordu. ABD'de biyolojik silah korku­sunun hat safhaya ulaştığı za­manlar da tehlikeli bir virü­sün yeniden yaratılması fazla sevinçle karşıla­namadı.Ven­ter'de çalışmayı "sorumsuzca, kış­kırtıcı ve bilimsel­lik sorumluluktan uzak" olarak de­ğerlendirdi. Araş­tırmacılar virüsü kısa baz dizilerini ucuca ekleyerek ürettikleri tamam­layıcı DNA'dan [cDNA] RNA poli-
meraz enzimiyle tek zincirli RNA sen-tezleyerek üretmiş. Bulaşıcı biçimi RNA olan virüs hücrelere verildiğinde doğal bir virüs gibi çoğalıp, protein kı­lıf üretip hücreden çıktıktan sonra di­ğer hücrelere bulaşmış. Fareler üze­rinde yapılan deneyler yapay virüsün, doğal virüsle aynı hastalık belirtilerine yol açtığını kısacası doğalından fark­sız olduğunu göstermiş.
Asgari Genom
Peki Venter'in sentezlemek için can attığı bu asgari genom nedir? Her şey 1995 yılında Venter'in başkanlığı­nı yaptığı TIGR'nin (The Institute For Genomic Research) insan üriner kana­lında yaşayan parazit bir bakteri olan
Nisan 2004 41 BİLİM VE TEKN İ K
Mycoplasma genitalium'un genomu­nun dizilimini çıkarmasıyla başlar. Yalnızca 580.000 baz çiftinden (580 kb) oluşan M. genitalium'un geno­munda yalnızca 517 gen vardı. Bu bir canlıdan bilinen en küçük gen sayı­şıydı. Minik genomun ortaya çıkma­sıyla akıllara bazı ternel sorular geldi: "Acaba bir hücrenin canlılığını koru­ması İçin gerekli gen sayısı ne kadar­dı? Tüm canlılarda ortak asgari bir gen takımı var mıydı?" Bu sorular, tüm organizmaların asgari veya gere­ğinden daha fazla miktarda bir gene­tik malzemeye ortak olarak sahip olup olmadıklarına ilişkin bir tartış­manın başlamasına yol açtı. Bir canlı­nın uygun koşullarda, canlılık için te­mel kabul edilen tüm işlevleri yerine getirmesini sağlayacak miktarda ge­netik bilginin bu asgari gen takımın­da bulunduğu ileri sürüldü: Bu, eğer varsa, yaşamın DNA üzerine yazılmış reçetesiydi. Günümüz canlıları "yaşa­mın zorunlu temel işlevlerine" ek ola-
tırır; onlara çok yönlü bir yaşam tarzı sağlar. Ancak, varlıkları zorunlu olma­yan ve genomu şişiren bu fazladan genlerin elenmesiyle, bu asgari geno­ma yeniden ulaşılabileceği düşünüldü. Gerçi herkes aynı kanıda değil: Bazı bilim adamları yaşamın bir genler top­lamından ibaret olmadığı düşüncesin-deyken, önemli bir çoğunlukda tek bir asgari gen takımı diye bir şey olama­yacağını, her ortamın koşullarına göre gerekli genlerin farklı olacağını dile getiriyor. Yine de bir grup bilim ada­mı, asgari gen takımını ortaya çıkar­mak için araştırmalara çoktan başla­mıştı.
Eğer varsa, asgari bir gen takımı­nın yapay yaşam araştırmaları için ne­den önemli olduğunu Imperial Colle-ge'dan Paul Davies şöyle anlatı-yor:"Canlı bir hücre şaşırtıcı karmaşık­lıkta, bilgiyi işleyen ve kopyalayan bir süper bilgisayar olarak düşünülebilir. DNA, yaşamın kaynağı olan özel bir molekül değil sahip olduğu bilişimi
Şekilde çemberler kabaca her bakterinin genom büyüklüğünü yansıtacak biçimde çizilmiş.
rak tamamen uyumsal nedenlerle da­ha karmaşık ve lüks diyebileceğimiz metabolik yollara sahip. Evrimsel sü­reç İçinde gerçekleşen, gen çiftlenme-leri [duplikasyon], yatay gen taşınması [lateral gen transferi] gibi olaylar can­lıların genom büyüklüğünü artırmış, çevresel değişimlere karşı gen ifadesi­ni düzenleyen kontrol mekanizmaları gelişmiş. Tüm bunlar canlıların yaşa­mını kolaylaştırıp, uyum yeteneğini ar-
Ortolog ve Paralog Genler ile Ortolog Olmayan Gen Değişimi
Homoloji, evrimsel analizin temel kavramla­rından biridir ve ortak atadan köken alındığına işaret eder. Ortak atadan gelen DNA dizileri in­celenirken homoloji kavramı birbirinden farklı iki kavramla karşılanır: Ortolog ve paralog genler. Ortolog iki gen, ortak atadan gelen iki organiz­manın aynı işlevi gören genleri için kullanılır. Bu iki gen, kendilerini taşıyan organizmaları iki farklı türe evrimleştiren süreçlerin benzerleri ta­rafından değiştirilir; birbirinden farklılaştırılır. Ortolog iki gen arasındaki farklılık miktarı, bu iki organizmanın ortak atalarından ayrıldıkları zamanın uzunluğuyla da ilişkilidir. Ortolog genle­rin belirlenmesi, organizmalar arası evrimsel iliş­kilerin ortaya çıkarılmasında oldukça önemlidir. Diğer yandan paralog genler, aynı organizmada (genomda) bulunan aynı kökenden gelmiş ancak farklı işlevleri olan genleri tanımlar. Evrimsel sü­reç içerisinde zaman zaman meydana gelen çift­lenme [duplikasyon] denilen bir çeşit mutas-yon, bir kromozom üzerinde bulunan bir ge­nin bir kopyasını daha üretir. Artık o genom, aynı genin iki kopyasını taşıyordur. Ancak, evrimsel değişimin bir kromozom üzerindeki iki farklı yer üzerindeki etkisi bile farklıdır ve başlangıçta aynı işlevi yerine getiren bu gen­ler, zamanla birbirinden farklılaşarak farklı İş­levler kazanmaya başlarlar. Paralog genlerin oluşması organizmaların yeni genler kazan­malarında oldukça önemli bir yoldur.
Asgari gen takımı araştırmaları, aynı et­kinliği gösteren proteinlerin ortolog olmaya­bileceğini ortaya çıkardı. Uzun zamandır fark­lı enzimlerin aynı aktiviteyi gösterebildiği bi­linse de bunun yaygınlığı hakkında fazla bir
Gen GA ve GB ortolog iki gen
Gen Gl ve G2 paralog iki gen
Tüm C genleri homolog G1A ve G2B genleri paralog C1A ve G1B genleri ortolog
bilgi yoktu. Ortolog olmayan gen değişimlerinin sıklığı bu araştırmalar sonucunda ortaya çıktı. Doksanlı yılların sonunda bakteri ve arkeaların
sitrik asit (Krebs) döngüsü enzimleri üzerinde ya­pılan bir araştırma, E.coli enzimlerinin %25'ten daha fazla bir bölümünün en az bir türde yer de­ğiştirmeye uğradığı ya da en azından olmadı­ğını göstermiş. Gen yer değiştirmelerine tüm enzim tiplerinde ve her biyolojik süreçte rast­lanmış.
Koonin ve ekibi, H. influenzae, M. genita-lium tüm genom dizilimini o zaman için bili­nen E.coli genleriyle ortolog olan genleri bul­mak için karşılaştırdıklarında %75'i bilinen E. coli genleri içinde H.influenzae'nın genlerinin %70'ine ait ortologlar bulunmuş. Filogenetik olarak çok daha uzak olan M. genitalium gen­lerinin de büyük bölümünün (her üç bakteri için ortak bir gen takımı dahil) H. influenzae ve E. coli genleri arasında ortologları vardı.
Ortologlar her üç genomda kodlanan pro­tein dizileri karşılaştırılarak belirlenmiş.
BİLİM ve TEKNİK 42 Nisan 2004
Kimyasal Yolla Sentezlenmesi
tamdaki vazgeçilmez genlerin listesi bize asgari genomu verecektir. Bu amaca yönelik ilk çalışmalar, rastgele seçilen gen bölgelerinin mutasyonlar-la işlevsiz hale getirilmesi ve elde edi­len verilerin istatistiksel olarak değer­lendirilmesine dayanıyordu. Bacillus subtilis'in tüm genom diziliminin bi­linmediği yıllarda, bakterinin 79 gen bölgesi üzerinde yapılan ilk çalışma, bu canlı için asgari genom büyüklüğü­nün 318-562 kb olması gerektiği orta­ya koydu. Bu büyüklük, 580 kb'lİk M. genitalium'un genom büyüklüğün bi­raz altındaydı.
Y
Karşılaştırmalı, Teorik, Evrimsel Genomik
Asgari gen takımını tanımlamaya yönelik ilk genom-sonrası çalışma, ABD Ulusal Sağlık Enstitüsü'nden Eugene Koonin ve ekibi tarafından, tüm genom dizilimleri ortaya çıkarılan ilk iki organizma olan Haemophilus influenzae ve Mycoplasma genitallum bakterileri üzerinde yapıldı. Çalışma iki bakterinin gen dizilerinin karşılaş­tırılması, evrimsel geçmişlerinin ince­lenmesine dayanıyordu. 468 protein kodlayan geniyle M. genitalium bili-nen en az sayıda gene sahip canlıydı ama bu genlerin de bir kısmı vazgeçi­lebilirler arasındaydı. Bu bir avuç ge­nin ne kadarının gerçekten vazgeçil­mez olduğunu belirlemek için araştırı­cılar H. influenzae'nın genomuyla, M. genitalium'un genomunun ürettiği tüm proteinleri birbiriyle karşılaştırdı­lar. Sırasıyla biri Gram pozitif, diğeri Gram negatif olan bu iki bakterinin son ortak ataları 1.5 milyar yıl önce yaşamış, dahası her ikisi de parazit olan bu canlılar bir dizi gen ayıklan­ması geçirerek genomlarını küçült-müşlerdi. Araştırıcılar her iki bakteri-
elektroforeziyle ayır ayrı saflaştırılması 2 gün
matematiksel bir kod kullanarak akta­ran bir genetik veri bankasıdır. Hücre­nin işlevlerinin pek çoğu, maddesel olan donanım düzeyinde değil, bilişim düzeyinde anlaşılabilir. Kimyasal mad­deleri bir tüpün içinde karıştırarak ya­şam elde etmeye çalışmak, kablo ve düğmeleri lehimleyerek Windows 98 elde etmeye benzer: İşe yaramaz, çün­kü soruna yanlış kavramsal düzeyde yaklaşılmıştır." Bir canlıya ait asgari gen takımını belirlemek; hücreyi oluş-turacak yapısal molekülleri üretmek üzere gerekli enzimlerin bilgisini, inerji akışının hangi ana metabolik oldan hangi enzimlerle sağlandığını, hücre bölünmesi için DNA'yı uygun biçimde kopyalayacak enzimleri bilgi­sini vb. belirlemek Davies'in sözünü ettiği işletim sisteminin kodlarını çöz­memiz anlamına geliyor.
Yaşam için gerekli olan asgari ge­nom büyüklüğünü tahmine yönelik ilk çalışmalar 1990'lı yılların ortaların­da başladı. Bakterilerin, bazı genleri­nin içine kısa DNA dizileri sokularak işlevsiz hale getirilmesine tolerans
gösterseler de, bazı gen bölgelerinin işlevini yitirmesine karşı son derece dayanıksız oldukları, mutasyonların doğasını anlamak üzere yapılan çalış­malardan bu yana biliniyordu. Bazı genlerin işlevsiz hale gelmesi, sentez-lenmeyen ürünün bakterinin üreme ortamına konmasıyla telafi edilse de, "vazgeçilmez genler" olarak adlandırı­lan bir grup genin işlevini yitirmesi, her koşulda bakterinin ölümüyle so­nuçlanıyordu. Bakterilere ihtiyaç duy­dukları hemen her maddeyi sağlayan son derece zengin bir besin ve uygun fiziksel koşulların sağlandığı bir or-
Nisan 2004 BİLİM ve TEKNİK
Çocuk Felci Virüsü (PV1(M) cDNA'sının Oluşturulma Stratejisi________
M. pneumoniae'ye özel mutasyon bölgelerinin ortalama yoğunluğunun her iki tür için de ortak olan bölgele­rin yoğunluğunun 5.5 katı olması, bu türe ait fazladan tüm genlerin vazgeçi­lebilir olduğu görüşünü destekliyor. Türe özgü mutasyon bölgelerine ek olarak gözlenen mutasyonların büyük bölümü, her iki tür için de ortak olan bölgelere dağılıyor. Tüm genom dizili­mi saptanmış üçüncü mikoplasma olan Ureaplasma urealyticum'la M. ge­nitalium da belirlenen gereksiz genle­rin karşılaştırılması ve bunların büyük çoğunluğunun Ureaplasma urealyti-cum'da bulunamaması, genlerin ge­reksizliğini destekleiyor.
M. genitalium'un tüm vazgeçilebilir genlerini hesaplamak için, her iki türe ait birikmiş genom bilgileri değerlendi­rildi ve vazgeçilebilir genlerin sayısının yaklaşık 180-215 arasında olması ge­rektiği bulundu. Bu, M. genitalium için vazgeçilmez protein kodlayan gen sa­yısının 265-350 arasında olduğu anla­mına geliyor. Venter'in deneyi sırasın­da transpozon mutasyonu ile işlevini kaybetmemiş 351 genin 111 tanesinin işlevinin bilinmemesi, deneyin en can alıcı sonuçlarından biri oldu. Her ne kadar mutasyon taşımayan genlerin ta­mamının vazgeçilmez genler olduğu söylemek mümkün olmasa da, büyük bir kısmının gerekli olduğunu söyleye­biliriz. Bilinen en basit hücresel yaşam biçiminin, hücresel işlevler için gerekli genlerinin önemli bir bölümünün işle­vinin bilinmemesi, hücresel yaşam için gerekli temel moleküler mekanizmala­rın tamamının henüz aydınlatılamamış olduğunu gösteriyordu.
Venter deneyini anlattığı makale­nin sonunda, gazete manşetlerine de yansıyacak arzusunu dile getirir: "Ge­rekli gen takımı asgari genomla aynı şey değil, vazgeçilebilir gibi gözüker bir gen başka koşullar altında vazge çilmez de olabilir. Burada sunulan ve riler asgari genoma sahip bir hücreyi laboratuvar ortamında İnşa etmek için, gerekli ilk deneyier için ip uçları veri­yor. Kendini kopyalayan yaşam için gerekli asgari genomu belirlemenin bir yolu takıp çıkarılabilir, yapay bir kromozom yapıp test etmekten geçi­yor. Bu, etik değerlendirme için bekle­tilen bir deney."
Venter'in mikoplazması, bilinen en az sayıda gene sahip canlı olsa da hak-
7500 bazdan (nükleotidden) oluşan virüs ge­nomunu sentezlemeye, ticari olarak satılan orta­lama 69 baz uzunluğunda uçiarı birbirini tamam­layıcısı olan saf, artı ve eksi kutuplu oligonükle-otid zincirlerinin birleştirilmesiyle başlandı. Bir DNA ikili sarmalının yalnızca bir zinciri protein sentezinde kullanılır, diğer zincir ise onun ta­mamlayıcısı olarak görev yapar. Bu zincirlerden protein sentezi için kullanılanı artı kutuplu, diğe­ri eksi kutuplu olarak tanımlanır. Birbirlerinin tamamlayıcısı olan bu kısa zincirlerin birleştiril­mesiyle ortalama uzunluğu 400-600 baz çifti (bç) olan ve yine yapışkan uçlar taşıyan zincirler elde edildi. Bu DNA parçaları da üç farklı plaz-miî içine yerleştirilecek üç büyük DNA dizisi el­de etmek üzere birleştirildi. Halkasal DNA mole­külleri olan plazmitler, bakteriler içinde kendi kendilerini kopyalayarak çoğaltabilen, bakteri kromozomlarına göre daha küçük işlevsel DNA'lardır. Genetik mühendisliğinde DNA'yı sonradan tekrar birleşebilecek şekilde kesebilen enzimlerle-restriksiyon enzimleri- yeniden biçim­lendirilmiş DNA parçalarını hücrelere sokmak için kullanılır. Wimmer'de küçük DNA zincirleri­ni uç uca ekleyerek elde ettiği normal yollarla sentezlenemeyecek uzunluktaki üç DNA parçası­nın her birini önce bir plazmit içine yerleştirmiş. Daha sonra bu plazmitleri teker teker enzimler­de de ortolog, yani genomlardaki iki farklı genin aynı kökenden gelip aynı işi yapan genlerin, asgari gen takımın­da büyük olasılıkla bulunmaları gerek­tiği görüşünden yola çıkmışlar. Ko-onin her İki bakteride ortolog olan 240 gen belirlemiş. Ancak''ortolog ol­mayan gen değişimi" nedeniyle bu sa­yı, tam olarak asgari gen takımına kar­şılık gelmiyor. Ekip, ortolog olmayan, ancak vazgeçilmez işlevlere ait 22 gen daha tanımlamış. Bunlardan parazit yaşamla ilgili olduğu belirlenen 6 ge­nin sonradan elenmesiyle: Çağdaş hücresel yaşama ait asgari gen takımı­nın 256 (yaklaşık 260) genden oluş­ması gerektiği sonucuna ulaşılmış. Bu sonuç, daha önceden B. subtilisle ya­pılan çalışmayla da uyumlu.
Venter İş Başında
1999 yılında Craig Venter asgari gen takımını belirlemek üzere o zama­na kadar yapılan en kapsamlı deneysel çalışmayı yayınladı. Venter araştırma­sında M. genitalium ve onun yakın ak­rabası Mycoplasma pneumoniae'yi kullandı. 580 kb'lık M. genitalium ge­nomunun 517 geninden protein şifre-
le kesip birbirine yapıştırarak sonunda tek bir plazmit içinde PV1 virüsünün genomunu oluştur­mak üzere birleştirmiş. Ancak PV1 virüsünün DNA'dan değil RNA'dan oluşan genomu, tamam­layıcı zincirden (cDNA) virüs RNA'sının sentezle-mesjyle bulaşıcı biçimine getirilmiş. DNA dizili­minde hatlarının olmaması için ince elenip sık dokunması ve her bir DNA zincirinin nereye na­sıl yerleştirileceğinin dikkatlice hesaplanmasının gerektiği bu çalışma yaklaşık 3 yıl sürmüş.
leyenleri sayısı, yenilerinin bulunma­sıyla 480'e ulaştı. Bakterinin bilinen en yakın akrabası olan M. pneumoni-ae'yle genomlarının karşılaştırılmasıy-la, M. pneumoniae'nin her bir M. geni­talium geni için bir ortolog taşıdığı ve bunlara ek olarak 197 tane de fazla­dan gen taşıdığını gösterdi. İki türün ortolog genleri arasında amino asit di­zi ortaklığının yaklaşık yalnızca %65 olması önemli boyutta bir evrimsel uzaklığa işaret ediyor. Bu durum Ven-ter'e iki organizma tarafından paylaşı­lan ve M. genitalium'un protein kodla-yan genlerinin toplamına eşit olan 480 genin, asgari gen takımına yakın­lığını test etme olanağı sağladı. Ven­ter, transpozon [yer değiştirici genetik elementler] denen ve DNA dizilimi bi­linen kısa DNA parçalarını bakterile­rin genleri içine sokarak, mutasyona uğrattığı genleri İşlevsiz hale getirdi. Mutasyona uğradığı halde hayatta kal­mayı başaran bakteri kolonileri, mu-tasyonu taşıdığı genin vazgeçilebilir olduğunu gösterecekti. Yaşayan M. genitalium kolonilerinde 140 farklı gende, M. pneumoniae kolonilerinde de 179 farklı gende transpozon oldu­ğu belirlendi.
BİLİM ve TEKNİK Nisan 2004
kında yeterli bilgiye sahip olmadığı­mız bir organizmaydı. Bu yüzden bak­terinin vazgeçilmez genlerin üçte biri­nin işlevinin bilinmemesi hücre biyo-lojisindeki bilgisizliğimizden daha çok mikoplazmalar hakkındaki bilgisizliği­mize yormak daha doğru olur. Ven-ter'in ekibi bu bilinmeyen 100 kadar geni araştıradursun, başka araştırma­cılar, laboratuvarların daha aşina ol­duğu iki bakterinin Escherichia coli ve Bacillus subtilis'in vazgeçilmez genlerinin listesini çıkarmak üzere ça­lışmalara başladı. Bu bakteriler hak­kında her ne kadar çok daha fazla şey bilinse ve üretilmeleri mikoplazmalara göre çok daha kolay da olsa, çok faz­la sayıda gen taşıdıkları için araştırma­cılara acı dolu gün ve geceler yaşattık­ları kesin. Her İki bakteri üzerinde ki araştırmada 2003 yılı içinde tamam­landı. Fransa Ulusal Tarım Enstitü-sü'nden Dusko Ehrlich ve 96 uluslara­rası katılımcının B. subtilis'in 4100 ge­ninin her birini tek tek işlevsiz hale getirdikleri araştırma sonucu bunlar­dan yalnızca 271'nin vazgeçilmez ol­duğunu bulundu. Bu sonuç Venter'in bulgularıyla uyuşuyor. Ancak, iyi tanı­nan bakterinin vazgeçilmez genleri içinde işlevi bilinmeyenlerin sayısı bir düzine kadar. E. coli'yle yürütülen ça­lışma sonucu ise toplam 3126 gen içinden 620'sinin vazgeçilmez olduğu görülmüş.
Farklı organizmalar üzerinde de benzeri çalışmalar sürüyor. Asgari gen takımı çalışmaları henüz kesin so­nuçlar vermekten uzak; ancak, Ven­ter'in değindiği yapay kromozomları sentezleyip, denemek için gerekli te­meli hazırlıyor.
mış moleküler bileşimlerin canlı kabul edilmesi gerektiği genel kabul görü­yor. Kendini yenilemek ve kopyala­mak, çevreden alman molekül ve ener­jinin hücresel biçimlere dönüştürül­mesini, evrimleşebilme de hücresel sü­reçlerde kalıtılabilir çeşitliliğin varlığı­nı gerektirir. Bu özellikleri taşıyan moleküler yaplar oluşturmanın en ko­lay yolunun DNA, RNA gibi bilişim po-limerlerinin ve hücresel bileşenleri, kimyasal olarak üreten ve düzenleyen metabolik sistemlerin lipit kesecikler gibi kapalı fiziksel hacimlerde topla­mak olduğunda görüş birliği var.
Biri ABD'deki Los Alamos Ulusal Laboratuvarı'nda (LANL), diğeri 7. Av­rupa Yapay Yaşam Konferansında dü­zenlenen iki çalıştayda yapay hücrele­rin kimyasal olarak inşa edilmesine yönelik yapılan çalışmalar değerlendi­rildi. Yaşamı yapı taşlarında yeniden yaratmaya yönelik çalışmaların çoğun­luğu kendini kopyalayabilen lipit kese­cikler tasarlamaya yoğunlaşmış. İçin­de kalıp kullanarak kendini kopyala­yabilen RNA moleküllerinin bulundu­ğu lipit kesecikler, kesecik yüzeyinin amino asitlerden protein üretiminde katalizör olarak kullanıldığı sistemler şimdiye değin üretimi başarılmış sis­temler arasında. Yapay hücre araştır­malarında farklı kimyasal sistemlerin başarılı biçimde kaynaştırılabilmesi en zorlayıcı sorunlardan biri. LANL'dan Steen Rasmussen ve ABD Argonne Ulusal Laboratuvarı'ndan Liaohai Chen'in birlikte tasarladıkları ilkin hücre genetik, metabolizma ve kapsa­yıcı moleküllerin tek bir kimyasal sis­temde birleştirilebildiği ilk açık örnek. Chen-Rasmussen İlkin hücresinde, li­pitlerden oluşan kapsayıcı molekülle­rin dış yüzeylerine PNA molekülleri bağlı. PNA nükleotidlerin şeker-fosfat
bağı yerine, yalancı peptid bağlarıyla birbirine bağlandığı DNA analoğu bir molekül. PNA'ların hem bilişim mole­külü hem de elektron taşıyıcı olarak görev yaptığı sistem, ışık enerjisi kul­lanarak lipit ve PNA molekülleri üre­ten bir metabolizmaya sahip. Sistemin lipit üretebildiği deneysel olarak ispat­lanmış ancak diğer özelliklerin deney­sel olarak kanıtlanması henüz başarı-lamamış.
Yapay hücre araştırmaları yaşamın doğası ve kökeni sorunlarına cevap bulmamıza yardım edecek, diğer yan­dan bu araştırmaların kendini yenile­yebilen ve kopyalayabilen nano-maki-neler gibi önemli teknolojik gelişmele­re de yol açacak. Var olan organizma­lardan farklı genetik ve metabolik özelliklere sahip nano-makineler ger­çek anlamıyla yaşayan bir teknoloji, ancak çok güçlü yeteneklere sahip ol­masının yanı sıra önemli sosyal ve ah­laki etkileri de olacak. Çalıştay katı­lımcılarının tümü eninde sonunda ya­pay hücrelerin üretileceği konusunda hemfikir ancak bunun ne zaman başa­rılabileceği konusunda bir fikir birliği yok.
Murat Gülsaçan
Kaynaklar
Venter C.J. el al., Genereting a Synthetic genome by whole genome assembly: 0X174 bacteriophage from synthetic oligonucleotids, PNAS, December 23 2003, vol 100 no.26
Osterınan A.L et al., Experimental Determination and System Level Analysis of Essential Genes in Eschericha coli MGI655, Jour­nal of Bacteriology. Oct. 2003. p 5673-5684
Konin E.V., Mushegian A. R., 1996 Complete genome sequences of cellular life forms: glimpses of theoretical evolutionary geno-rriics
The minimal genom concept 1999, Arcady Mushegain
Tne search for essential genes Reich K. A., 2000
Bedau M.A., Artificial Life: organization, adaptation and complexity from the bottom up, TRENDS in Cognitive Sciences, Vol.7 No.11 November 2003
Wimmer £. et at., Chemical Synthesis of Poliovirus cDNA: Generati­on of Infectious Virus in the Absence of Natural Template, Sci­ence, Vol. 297, 9 August 2002
Bernharıt Falson, Tinker, Tailor: Can Venter Stildi Together a Geno­me From Scratch? Science, Vol 299 14 February 2003
Rasmussen S, et al.,Transitions from Nonliving to Living Matter, Science,
303, 13 February 2004
Yokuş Yukarı
Venter'in yapay yaşam üretme yak­laşımı "tepeden aşağı" [top down] bir yöntem, karmaşık ve büyük olandan daha basit ve küçük bir biçim üretme­ye dayanıyor. Ancak gerçek anlamda yapı taşlarından bir canlı sentezleme-ye çalışanlardan var. Bu yokuş yukarı [bottom upj tekniğin kullanımı henüz emekleme aşamasında ancak tatmin edici sonuçlar alınmaya başlandı bile.
Her ne kadar yaşamın tanımı tartış­malı da olsa, kendini sürekli yenileyip, kopyalayabilen ve evrimleşme potan­siyeline sahip küçük bir alanda toplan-
Nisan 2004 BİLİM ve TEKNİK